Abstract
Objective Degradative enzymes such as matrix metalloproteinase (MMP) and disintegrin metalloproteinase
with platelet thrombin-sensitive protein-like motifs (ADAMTS) play a key role
in the development of osteoarthritis (OA). We aimed to investigate the effects of
OA subchondral osteoblasts on the expression of ADAMTS4, ADAMTS5, MMP-3, MMP-9, and
MMP-13 in chondrocytes
and the regulation of mitogen-activated protein kinase (MAPK) signaling pathway.
Methods A rat knee OA model was constructed by cutting the anterior cruciate ligament of
the knee joints, and normal rat articular cartilage chondrocytes (N-ACC), OA rat articular
cartilage chondrocytes (O-ACC), normal subchondral bone osteoblasts (N-SBO), and OA
subchondral bone osteoblasts (O-SBO) were isolated and extracted. The expressions
of O-ACC and O-SBO
COL1 and COL2 were detected respectively. Chondrocytes were identified by immunofluorescence
of COL2 and toluidine blue staining, and osteoblasts were identified by COL1
immunofluorescence, alkaline phosphatase (ALP), and Alizarin Red staining. Gene expression
of COL1, COL2, and aggrecan in normal chondrocytes and OA chondrocytes, and gene expression
of
osteoblast ALP and osteocalcin (OCN) were detected by RT-PCR to identify the two chondrocytes
and the two osteoblast phenotypes. The constructing N-ACC group, O-ACC group, N-ACC
+ N-SBO
group, N-ACC + O-SBO group, O-ACC + N-SBO group, O-ACC + O-SBO group, I + N-ACC +
O-SBO group, and I + O-ACC + O-SBO group cell cultures, and the expression of ERK,
ADAMTS4, ADAMTS5,
MMP-3, MMP-9, and MMP-13 genes in chondrocytes cultured for 0, 24, 48, and 72 h were
detected by RT-PCR. The protein expressions of pERK, ADAMTS4, ADAMTS5, MMP-3, MMP-9,
and MMP-13 were
detected by Western blot.
Results
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The X-ray showed that the knee joint space of the affected limb became narrow.
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The results of RT-PCR of COL2 and aggrecan gene in OA and normal chondrocytes suggest
that the relative expression of COL2 in OA articular chondrocytes (0.24 ± 0.07) is significantly
lower than that in normal cartilage (0.61 ± 0.07) (p < 0.05). The relative expression
of AGG (0.37 ± 0.16) in OA chondrocytes was significantly lower than that of normal
chondrocytes AGG (1.30 ± 0.25) (p < 0.05). The expression of COL1 was very low, and
was not statistically significant.
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The results of RT-PCR of the osteoblast ALP and OCN gene indicated that gene expression
of ALP (12.30 ± 1.17) and OCN (20.47 ± 4.19)was upregulated when compared with the
relative
expression of ALP (4.66 ± 0.71) (p < 0.05) and OCN (12.17 ± 2.76) (p < 0.05) in normal
osteoblasts, indicating that osteoblasts of OA have greater osteogenic potential than
normal osteoblasts.
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The expressions of ADAMTS4, ADAMTS5, MMP-3, MMP-9, and MMP-13 genes and proteins in
OA chondrocytes or normal chondrocytes were basically unchanged when they were cocultured
with
normal osteoblasts. Indirect coculture of OA osteoblasts and chondrocytes could promote
the expression of ADAMTS4, ADAMTS5, MMP-3, MMP-9, and MMP-13 genes and proteins in
chondrocytes.
Overexpression of ADAMTS and MMP in coculture systems can be reversed by MAPK-ERK
inhibitors.
Conclusions
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OA subchondral bone osteoblasts can promote the overexpression of ADAMTS and MMPs
in chondrocytes.
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The ERK signaling pathway may be involved in the regulation of the effect of subchondral
bone osteoblasts on chondrocytes.
Zusammenfassung
Zielsetzung: Enzyme wie Matrix-Metalloproteinase (MMP) und ADAMTS spielen eine Schlüsselrolle
bei der Entstehung der Osteoarthritis (OA). Das Ziel der Studie war es, die
Auswirkungen subchondraler Osteoblasten auf die Expression von ADAMTS4, ADAMTS5, MMP-3,
MMP-9 und MMP-13 in Chondrozyten und die Regulation des Mitogen-aktivierten
Proteinkinase-(MAPK-)Signalwegs in der OA zu untersuchen.
Methode: Ein OA-Rattenknie-Modell wurde konstruiert, indem das vordere Kreuzband der Kniegelenke
und normale Ratten-Chondrozyten (N-ACC), OA-Ratten-Chondrozyten (O-ACC), normale
subchondrale Osteoblasten (N-SBO) und OA subchondrale Osteoblasten (O-SBO) isoliert
und extrahiert wurden. Die Expressionen von O-ACC und O-SBO COL1 bzw. COL2 wurden
nachgewiesen.
Chondrozyten wurden durch Immunfluoreszenz von COL2 und Toluidinblau-Färbung identifiziert,
Osteoblasten wurden durch COL1-Immunfluoreszenz, alkalische Phosphatase (ALP) und
Alizarin-Rot-Färbung identifiziert. Die Genexpression von COL1, COL2 und Aggrecan
in normalen Chondrozyten und OA-Chondrozyten sowie die Genexpression von Osteoblasten-ALP
und Osteocalcin
(OCN) wurden durch RT-PCR nachgewiesen, um die beiden Chondrozyten und die beiden
Osteoblasten-Phänotypen zu identifizieren. Die aufbauende N-CC-Gruppe, O-ACC-Gruppe,
N-ACC + NSBO-Gruppe,
N-ACC + O-SBO-Gruppe, O-ACC + N-SBO-Gruppe, O-ACC + O-SBO-Gruppe, I + NACC + O-SBO-Gruppe
und I + O-ACC + O-SBO-Gruppe-Zellkulturen und die Expression von ERK, ADAMTS4, ADAMTS5,
MMP-3,
MMP-9- und MMP-13- Gene in 0, 24, 48 und 72 h kultivierten Chondrozyten wurden durch
RT-PCR nachgewiesen. Die Proteinexpressionen von pERK, ADAMTS4, ADAMTS5, MMP-3, MMP-9
und MMP-13 wurden
durch Western Blot nachgewiesen.
Ergebnisse:
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Im Röntgenbild zeigte sich eine Kniegelenkspaltverengung.
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Die Ergebnisse der RT-PCR von COL2 und dem Aggrecan Gen in OA und normalen Chondrozyten
legen nahe, dass die relative Expression von COL2 in artikulären Chondrozyten von
OA
(0,24 ± 0,07) signifikant niedriger ist als die in normalem Knorpel (0,61 ± 0,07)
(p < 0,05). Die relative Expression von AGG (0,37 ± 0,16) in OA-Chondrozyten war signifikant
niedriger als die von normalen Chondrozyten-AGG (1,30 ± 0,25) (p < 0,05). Die Expression
von COL1 war sehr gering und statistisch nicht signifikant.
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Die Ergebnisse der RT-PCR des Osteoblasten-ALP- und OCN-Gens zeigten, dass die Genexpression
von ALP (12,30 ± 1,17) und OCN (20,47 ± 4,19) im Vergleich zur relativen Expression
von
ALP (4,66 ± 0,71) (p < 0,05) und OCN (12,17 ± 2,76) (p < 0,05) bei normalen Osteoblasten
hochreguliert war, was darauf hindeutet, dass Osteoblasten von OA ein größeres osteogenes
Potenzial haben als normale Osteoblasten signifikant.
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Die Expressionen der ADAMTS4-, ADAMTS5-, MMP-3-, MMP-9- und MMP-13-Gene und -Proteine
in OA-Chondrozyten oder normalen Chondrozyten waren im Wesentlichen unverändert, wenn
sie mit
normalen Osteoblasten kokultiviert wurden. Indirekte Kokultur von OA-Osteoblasten
und Chondrozyten könnte die Expression der Gene und Proteine ADAMTS4, ADAMTS5, MMP-3,
MMP-9 und MMP-13
in Chondrozyten fördern. Die Überexpression von ADAMTS und MMP in Kokultursystemen
kann durch MAPK-ERK-Inhibitoren rückgängig gemacht werden.
Schlussfolgerungen:
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Subchondrale Osteoblasten in OA Gelenken können die Überexpression von ADAMTS und
MMPs in Chondrozyten fördern.
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Der ERK-Signalweg kann an der Regulation der Wirkung subchondraler Knochenosteoblasten
auf Chondrozyten beteiligt sein.
Key words
Osteoarthritis - chondrocytes - osteoblasts - ERK signaling pathway
Schlüsselwörter
Arthrose - Chondrozyten - Osteoblasten - ERK-Signalweg
